کربوهیدرات‌ها یکی از مهمترین ترکیبات موجود در بیشتر مواد غذایی می‌باشند که به صورت مولکول‌های مجزا بوده و یا به صورت مشارکت فیزیکی و یا از طریق پیوند شیمیایی با دیگر مولکول‌ها ارتباط برقرار می‌نمایند. قندها، کربوهیدرات‌های ساده‌ای می‌باشند که جهت عملکرد زندگی هر شخصی الزامی و مهم می‌باشد. قندها به صورت کریستالی، محلول در آب و غالبا" با طعم شیرین هستند.                                

از آن جایی‌که کربوهیدرات‌ها در بردارنده گونه‌های کروموفور نمی‌باشند، از این رو آشکارسازی با طیف‌سنجی ماورای بنفش (UV ) تنها از طریق تلفیق با برخی از فرم‌های مشتق سازی پس از ستون امکان پذیر می‌باشد. آنالیز قندها با آشکارساز UV دارای حساسیت کم بوده و کاربرد بسیار کمی دارد. آشکارسازی با اندیس شکست ( RI ) با استفاده از کروماتوگرافی تبادل آنیونی انجام می‌پذیرد. اما این روش دارای حساسیت کم ( حد تشخیص بیشتر از 100 میلی‌گرم بر لیتر ) بوده و نسبت به آشکارسازی پالس آمپرومتری ( PAD ) از عمومیت کمتری برخوردار می‌باشد.
استفاده عمده آشکارساز پالس آمپرومتری در کروماتوگرافی آنیونی در تعیین مقدار کربوهیدرات‌ها می‌باشد. درpHهای11 و بالاتر قندها به صورت آنیونی درآمده و توسط کروماتوگرافی آنیونی قابل آشکارسازی می‌باشند. با توجه به این‌که اکسیژن دارای پاسخ کاتدی در سطح الکترود پلاتین در گستره کامل آشکارسازی آندی می‌باشد، استفاده از الکترودهای طلا در PADنسبت به الکترودهای پلاتین ترجیح داده می‌شود. استفاده از الکترود طلا سبب می‌شود که با بهینه نمودن پتانسیل آشکارسازی از تداخل‌های اکسیژن جلوگیری بعمل آید. دستگاه i871 Advanced Bioscan ساخت کمپانی Metrohm سوئیس یک دستگاه اندازه‌گیری تحت کنترل کامپیوتر جهت آنالیز حساس کروماتوگرافی یونی با استفاده از آشکارساز پالس آمپرومتری می‌باشد که جایگزین دستگاه Bioscan 817 گردیده است. در مدل جدید با بهبود در سیستم الکترونیکی دستگاه مقدار نویز به میزان قابل توجهی کاهش یافته است. این واحد در تلفیق با پمپ کروماتوگرافی یونی e818 و سل اندازه‌گیری مورد استفاده قرار می‌گیرد که در شکل 1 نمایی از این سیستم نشان داده شده است.
کمپانی Metrohm یک ستون جداسازی جدید با ظرفیت بالا به نامMetrosep Carb 1 جهت اندازه‌گیری کربوهیدرات‌ها با استفاده از حلال‌های قلیایی و آشکارساز پالس آمپرومتری ارائه نموده است. مواد تبادل یونی بر پایه کوپلی‌مر استایرن – دی وینیل بنزن، ایجاد شرایط کاری پایدار وجداسازی مناسب بین مونو و دی ساکاریدها و نیز آنالیز قند الکل‌ها و الیگوساکاریدها می‌نماید.
محفظه فشردهBioscan شامل اجزای کروماتوگرافی یونی متفاوتی می‌باشد. آشکارساز، یک سل در مسیر جریان ( flow through cell ) با ساختار سه الکترودی جهت آشکارسازی آمپرومتری در حالت‌های DC اسکن و پالس می‌باشد. سل آشکارساز متشکل از یک الکترود کار طلا، الکترود کمکی فولادی و یک الکترود مرجع فاز جامد می‌باشد. عایق‌کاری کامل اجزای ستون نه تنها شرایط گرمایی پایدار برای ستون‌های جداسازی ایجاد می‌نماید بلکه سبب حفاظت سیستم از تداخل‌گرهای الکترومغناطیسی نیز می‌گردد. با استفاده از آون حرارتی تعبیه شده در دستگاه از این‌که تمام اجزای مهم به یک ثابت دمایی از 5 درجه سانتی‌گراد بالای دمای محیط تا 60 درجه سانتی‌گراد با پایداریq±0.1?C برسد اطمینان حاصل نمود. جدا از الکترودها، تمام اجزای دستگاه که در تماس با حلال و نمونه هستند عاری از فلز می‌باشند. مقدارpH حلال تاثیر مستقیم برروی واکنش الکتروشیمیایی ایجاد شده در سطح الکترود کار دارد. به منظور داشتن خط زمینه پایدار و نیز شرایط اندازه‌گیری تکرارپذیر باید از صحتpH حلال اطمینان حاصل نمود. از آن‌جایی‌که واکنش الکتروشیمیایی در سطح الکترود به انتقال مواد واکنش دهنده به سمت الکترود وابسته می‌باشد، انتقال عاری از پالس با استفاده از جاذب پالس توصیه می‌گردد. دستگاه Bioscan اندازه‌گیری کربوهیدرات‌ها، الکل‌ها و قند الکل‌ها را در ماتریس‌های متنوعی از جمله نوشیدنی‌های غیر الکلی، آب میوه‌ها، محصولات لبنی، شیرین کننده‌ها، شکلات، شیرینی و آدامس امکان‌پذیر می‌سازد. حدهای تشخیص با استفاده از ستون جداسازی Metrosep Carb 1 در حدود 20-100 میکروگرم بر لیتر( ppb ) در شرایط کاری استاندارد می‌باشد. به منظور آنالیز نوشیدنی کولای معمولی و کولای رژیمی، نمونه‌ها به نسبت 1:1000 با آب دیونیزه رقیق و گاززدایی گردیده و سپس از طریق فیلتر 45/0 میکرون قبل از آنالیز فیلتر می‌گردد. مقادیر گلوکوز‌، فروکتوز و سوکروز در کولای معمولی به ترتیب 1/19، 5/18، 6/67 گرم بر لیتر بوده در حالی‌که در کولای رژیمی دارای میزان مانیتول 0009/0 گرم بر لیتر، گلوکوز 069/0 گرم بر لیتر و زایلوز 0015/0 گرم بر لیتر و مقادیر کمی گلیسرول می‌باشد. در مقایسه با کولای معمولی، کولای رژیمی دارای مقادیر کمی از کربوهیدرات می‌باشد. در شکل 2 و 3 آنالیز نوشیدنی کولای معمولی و رژیمی نشان داده شده است .
جهت آماده‌سازی نوشیدنی‌ها استفاده از آب فوق خالص الزامی می‌باشد. بیشتر کارخانجات نوشابه‌سازی عملکرد به خصوصیت جهت تصفیه و خالص سازی آب دارند. معمولا" آب شهر از طریق غشاء اسمز معکوس (RO) عبور داده می‌شود و خروجی فرایندRO جهت حذف میکروب ازونیزه می‌گردد. قبل از فرایند ازونیزه نمودن، آب با نمک‌های بسیار خالص مانند کلرید سدیم، سولفات منیزیم و کلرید کلسیم به منظور ایجاد قدرت یونی مناسب تقویت می‌گردد. در صورت حضور برمید در نمک‌های معدنی امکان اکسید شدن جزیی آن به یون برمات که قابلیت سرطان زایی دارد وجود دارد. از این رو تعیین مقادیر کم برمید در نمک‌های معدنی از اهمیت ویژه‌ای برخوردار می‌باشد. در شکل 4 اندازه‌گیری برمید در نمک‌های معدنی با آشکارسازی مستقیمUV نشان داده شده است.
برای اندازه‌گیری میزان کربوهیدرات‌ها در نمونه آدامس بدون قند، 10 میلی‌گرم از آدامس بریده شده و به یک لیتر آب دیونیزه اضافه می‌گردد. محلول حاصل شده با استفاده از حمام فراصوتی قبل از آنالیز Sonicate می‌شود. مقادیر زلیتو ( Xylito1) سوربیتول، مانیتول و گلوکوز به ترتیب 132، 321، 46 و 15 میلی‌گرم بر لیتر می‌باشند که در شکل 5 مشاهده می‌شود.
اندازه‌گیری قندها و قند الکل در ماست میوه‌ای در شکل 6 نشان داده شده است. 10 گرم از ماست را در یک لیتر آب فوق خالص حل نموده و محلول حاصله را به نسبت 1:10 رقیق می‌نماییم. نتایج 2/0، 8/0، 21، 4/7، 1/16، 5/26 و 77 میلی‌گرم بر گرم به ترتیب برای اینوزیتول، سوربیتول، گلوکوز، گالاکتوز، فروکتوز، لاکتوز و سوکروز حاصل گردیده است
با استفاده از دستگاه i817 Bioscan اندازه‌گیری گالاکتوز، فروکتوز و لاکتوز در غذای کودکان امکان‌پذیر می‌باشد. جهت این آنالیز 1 گرم از پودر نمونه را در یک لیتر آب فوق خالص به حالت معلق درآورده و محلول حاصل را سپس به نسبت 1:10 رقیق می‌نماییم. در شکل 7 اندازه‌گیری مونو و دی ساکاریدها در غذای کودکان مشاهده می‌شود.
آنالیز ترکیبات مختلف قندهای موجود در محلول‌های حاصل از مراحل مختلف فرایند استخراج چغندرقند بر روی ستون‌ Metorsep Carb 1-250 و استفاده از حلال هیدروکسید سدیم و آشکارسازی پالس آمپرومتری امکان پذیر می‌باشد که در شکل 8 مشاهده می‌شود.
عسل یکی از مواد طبیعی حاصل از نکتار و رسوبات شیرین گیاهان می‌باشد که توسط زنبور در کندوی زنبور عسل جمع آوری و ذخیره می‌شود. ترکیب عسل بسیار متغیر می‌باشد و اصولا" از قندهای ساده مانند گلوکوز و فروکتور تشکیل می‌شود. شیرینی عسل‌هایی که حاصل از یک گل تنها می‌باشد بستگی به نسبت گلوکوز و فروکتور دارد. همچنین عسل در بردارنده انواع دیگری از قندها مانند سوکروزو آب نیز می‌باشد. ترکیب نوعی عسل شامل مواد زیر می‌باشد:
فروکتوز 38/38% ( از محدوده 90/30%- 25/44% ) گلوکوز: 30/30 % ( از محدوده 90/22% - 40/75 %) آب /20 ( از محدوده /4- 22/9 %) و سوکروز : 31/1 % ( از محدوده %0/25- %7/57 ).
به منظور بدست آوردن سود تجاری فراوان، امکان تولید تقلبی عسل وجود دارد. این امر با مخلوط نمودن شیره ذرت با فروکتوز بالا و یا شکر زرد تحقق می‌پذیرد. از آنجایی که این پی بردن به تقلبی بودن عسل به صورت آزمایش چشمی و یا مزه نمودن آن امکان پذیر نمی‌باشد، از این رو با آنالیز نمودن نسبت فروکتوز به گلوکوز می‌توان تقلبی بودن عسل را آشکار نمود. معمولا" در صورتی که نسبت فروکتوز به گلوکوز 2:1 باشد بیانگر خلوص عسل می‌باشد. در نمونه‌های تقلبی با قند یا شکر این نسبت به مقدار کمتری کاهش پیدا می‌کند.
نسبت گلوکوز به فروکتوز در عسل به راحتی و با دقت بالا با استفاده از کروماتوگرافی یونی با آشکارساز پالس آمپرومتری قابل اندازه‌گیری می‌باشد. نمونه با آب دیونیزه با حرارت دادن به منظور کمک به عمل حل شدن به نسبت 1:10000 رقیق گردیده و از طریق فیلتر 45/0 میکرون قبل از تزریق بهi817 Bioscan فیلتر می‌گردد. جداسازی از طریق ستون Metorsep Carb 1 با فاز متحرک هیدروکسید سدیم انجام می‌پذیرد که در شکل 9 مشاهده می‌گردد.
در شیمی غذایی تعیین مقادیر قندها در محصولات لبنی از اهمیت فوق العاده‌ای برخوردار می‌باشد. هنگامی که اندازه‌گیری از طریق کروماتوگرافی یونی به صورت مستقیم انجام پذیرد، رسوب پروتئین‌ها اثرات مخربی بر روی ستون جداسازی ایجاد می‌نماید. استفاده از روش‌های رسوبی ( مانند روش رسوبی Carrez ) قبل از آنالیز سبب جلوگیری از این مشکل خواهد شد. با این حال این قبیل مرحله رسوب نمودن نمونه منجر به هم رسوبی و حتی تجزیه و تفکیک قندها می‌گردد. با استفاده از روش دیالیز می‌توان بر این مشکل غلبه نمود.
دیالیز یک روش مناسب جهت جداسازی مواد با مولکول‌های کوچک از مواد با ملکول‌های بزرگ ( کلوئیدها ) از طریق یک غشاء نیمه تراوا می‌باشد. این روش همچنین تحت عنوان "شویش خون" نامیده می‌شود و مورد استفاده بیمارانی که از ناتوانی مزمن کلیه رنج می‌برند می‌باشد.
مواد با ملکول‌های کوچک موجود در خون شامل یون‌هایی می‌باشند که در تعادل الکترولیتی موثر می‌باشند. اگر کلیه کارایی خود را از دست دهد و به طور مناسبی عمل ننماید غلظت یون‌ها در خون افزایش خواهد یافت و در نتیجه عملکرد متابولیکی آن اثر مطلوبی نخواهد داشت. این بدین معناست که غلظت یون‌ها باید به صورت زمان‌های متوالی و منظم کاهش پیدا کند. این کار از طریق دیالیز با روش "جریان پیوسته" انجام می‌پذیرد که در شکل 10 نشان داده شده است.
محلول پذیرنده با قدرت یونی بسیار پایین – معمولا" آب فوق خالص – به سمت غشاء نیمه تراوا پمپ می‌شود. جریان خون نیز از سمت دیگر غشاء عبور داده می‌شود. یون‌های موجود در نمونه خون با قدرت یونی بالا، از میان غشاء به سمت محلول پذیرنده با قدرت یونی پایین عبور می‌نماید. در روش "جریان پیوسته" محلول پذیرنده به طور دایم تجدید و نو می‌گردد. باید دقت شود که تعادل غلظتی بین دو محلول پذیرنده و نمونه صورت نگیرد.
آماده‌سازی نمونه بوسیله دیالیز، یک روش کاملا" متفاوت با روش فوق می‌باشد. محلول پذیرنده و محلول نمونه باید حتما" دارای غلظت یکسان باشند تا نتایج درستی حاصل گردد. بدین منظور شرکت Metrohm سوئیس روش دارای حق امتیاز "جریان ایستا" را توسعه داده است. مانند روش "جریان پیوسته" محلول نمونه به صورت پیوسته به سمت غشاء نیمه تراوا پمپ می‌شود که در شکل 11 قابل مشاهده می‌باشد. تفاوت آنها در ثابت ماندن محلول پذیرنده در روش "جریان ایستا" می‌باشد. این بدان معنی می‌باشد که تعادل بین نمونه محلول و نمونه پذیرنده برقرار می‌شود. بسته به نوع ماتریس نمونه و میزان نمونه با ملکول‌های بزرگ، این عملیات کمتر از ده دقیقه در سل جدید Metrohm به طول می‌انجامد.
هنگامی که تعادل برقرار گردید، محلول پذیرنده همراه با نمونه دیالیز شده به سمت محفظه نمونه انتقال پیدا کرده و تزریق صورت می‌گیرد. شیر کنترل در سیستم کروماتوگرافی یونی Metrohm اجازه می‌دهد در حالی‌که یک نمونه اندازه‌گیری می‌شود نمونه بعدی قبلا" دیالیز شده باشد که این امر باعث صرفه‌جویی در وقت می‌شود. این سیستم، شبیه به هر سیستم کروماتوگرافی یونی، به راحتی کالیبره می‌شود. کارایی دیالیز با مقایسه بین تزریق مستقیم و دیالیز قابل تعیین بوده و در محدوده بین 97 درصد تا 99 درصد می‌باشد. توصیه می‌شود که استاندارد مرجع که سطح زیر پیک آن مشخص می‌باشد هر روز اندازه‌گیری شود. این کار باعث می‌شود که عملکرد سیستم براحتی کنترل گردد. بسته به نوع ماتریس نمونه، طول عمر کاری غشاء تا یک هفته و یا بیشتر از صد تزریق می باشد.
جداسازی قندهای با جرم ملکولی پایین از پروتئین‌ها با جرم ملکولی بالا به طور عمده توسط فشار اسمتیک در غشاء انجام می‌پذیرد. این بدین معناست که به واسطه تفاوت غلظتی موجود در دو سمت غشاء سلولوزی، قندها از سمت جریان نمونه به سمت محلول پذیرنده ( آب فوق خالص ) مهاجرت نموده و اجزای پروتئین با جرم مولکولی بالا در سمتی از غشاء که نمونه در جریان است قرار می‌گیرد. این مرحله آماده سازی به صورت خطی و در جریان (inline) انجام می‌پذیرد و در نتیجه به طور کامل خودکار می‌باشد. زمان مورد نظر برای عمل دیالیز قابل چشم پوشی می‌باشد، زیرا عمل دیالیز در حین ثبت کروماتوگرام نمونه قبلی انجام می‌پذیرد.
فرایند آماده سازی نمونه به صورت خطی در 4 مرحله به وقوع می پیوندد که عبارتند از:
1- شستشوی سیستم آماده سازی نمونه
2- دیالیز نمونه ( در حالت در جریان بودن محلول نمونه و ساکن بودن محلول پذیرنده )
3- انتقال محلول پذیرنده که حاوی آنالیت بوده به محفظه تزریق با در جریان بودن نمونه و محلول پذیرنده
4- تزریق محلول پذیرنده به سیستم کروماتوگرافی یونی
جهت انجام عمل دیالیز بوسیله واحد دیالیز بکارگیری مایع کروماتوگرافی یونی i833 نیاز به دو پمپ پریستالتیک می‌باشد. یک پمپ ( واحد دیالیز i833) جهت انتقال محلول پذیرنده و دیگری ( واحد پمپ i833 ) جهت انتقال نمونه بکار گرفته می‌شود. یک کانال از هر پمپ جهت انتقال محلول به سلول دیالیز و کانال دوم جهت برداشتن محلول از سلول دیالیز مورد استفاده قرار می‌گیرد. استفاده از این سیستم، جریان ثابت و شرایط فشار ثابت در دو جهت غشاء دیالیز را تضمین می‌نماید. در شکل 12 نمایی از این سیستم نشان داده شده است.
شیر و عسل تنها مواد غذایی هستند که تنها عملکرد آن‌ها در طبیعت، در مواد غذایی می‌باشد. نقش اساسی شیر در تغذیه می‌باشد. شیر یک ماده غذایی بسیار پیچیده بوده که در بردارنده بالغ بر صد هزار مولکول می‌باشد. بنابراین، معمولا تنها یک ترکیب تقریبی از شیر داده می‌شود. شیر ترکیبی از آب، هیدرات کربن، چربی، پروتئین، مواد معدنی و ویتامین می‌باشد. شیر و محصولات حاصل از آن روزانه به گونه‌های مختلفی مورد استفاده قرار می‌گیرد. تقاضای مصرف کنندگان برای استفاده از شیر با کیفیت بسیار بالا مسئولیت چشمگیری در فرایندهای لبنی، خرده فروشی‌ها و تولید کننده‌هایی که مسئول تولید شیر و محصولات حاصل از شیر سالم هستند ایجاد می‌نماید. در حال حاضر آزمایش‌ها و آنالیزهای متنوعی جهت آزمایش خلوص در ترکیبات شیر و محصولات حاصل از آن انجام می‌پذیرد. اغلب این آزمایش‌ها جهت کنترل کیفیت شیر بکار گرفته می‌شود.
لاکتوز( دی ساکارید حاصل از D – گلوکوز و D – گالاکتوز ) از عمده‌ترین هیدرات کربن موجود در شیر در اکثر نمونه‌ها می‌باشد. علاوه بر لاکتوز، شیر در بردارنده کربوهیدرات‌های دیگری در میزان کم از قبیل گلوکوز، گالاکتوز و الیگوساکاریدها نیز می‌باشد. لاکتوز کربوهیدراتی می‌باشد که تنها در شیر یافت شده و در هیچ جای دیگری در طبیعت یافت نمی‌شود. لاکتوز جهت تهیه بیشتر فرآورده‌های لبنی از قبیل ماست مورد استفاده قرار می‌گیرد. امکان آنالیز کربوهیدرات‌های متعدد موجود در شیر با استفاده از سیستم کروماتوگرافی یونی و آشکارساز پالس آمپرومتری وجود دارد. کروماتوگرام نوعی در شکل 13 آورده شده است.
تمام مواد معدنی که در رژیم غذایی انسان ضروری می‌باشند در شیر گاو یافت می‌شود. با این وجود عمده مواد معدنی موجود در شیر، کلسیم و فسفر می‌باشد. نمک‌های معدنی موجود در شیر شامل دو فرم می‌باشد که عبارتند از: 1) یون‌های با وزن مولکولی پایین ( نمک‌های نفوذ پذیر )، 2) نمک‌های غیر قابل نفوذ پذیر که با پروتئین پیوند برقرار می‌کنند. کاتیون‌های معمول در شیر شامل پتاسیم، سدیم، کلسیم، منیزیم و بیشتر آنیون‌های معمول شامل کلر و فسفات معدنی می‌باشند. از میان این یون‌ها، پتاسیم، سدیم و کلر تماما" نفوذ پذیر می‌باشند. یون‌های عمده فاز غیر قابل نفوذ ( کلوئیدی ) شامل کلسیم، منیزیم، فسفات معدنی و سیترات می‌باشند که با مایسل کازئین پیوند تشکیل می‌دهند.
مقادیر کم یدید باعث اختلال در تیروئید می‌شود. در صنعت لبنیات، از یدوفر به عنوان مواد ضد عفونی کننده استفاده می‌شود که سبب افزایش مصرف یدید در اشخاص می‌گردد. از این رو تعیین مقدار یدید در رژیم غذایی از اهمیت ویژه ای برخوردار می‌باشد که در شکل 14 اندازه‌گیری یدید با استفاده از آشکارسازی الکتروشیمیایی در محصولات لبنی نشان داده شده است.
اندازه‌گیری آنیون‌های مختلف در نمونه شیر با استفاده از سیستم دیالیز به عنوان سیستم آماده سازی نمونه که سبب حذف مولکول‌های بیولوژیکی و ماتریس با وزن مولکولی بالا می‌شود در شکل 15 مشاهده می‌شود.
علاوه بر اندازه‌گیری آنیون‌ها امکان اندازه‌گیری کاتیون‌های مختلف در نمونه شیر وجود دارد. در شکل 16 اندازه‌گیری کاتیون‌های موجود در شیر با استفاده از سیستم دیالیز نشان داده شده است.
اندازه‌گیری آنیون‌ها و کاتیون‌های مختلف در نمونه آب پرتقال با استفاده از آماده سازی نمونه inline با روش دیالیز امکان پذیر می‌باشد که در شکل 17 و 18 نشان داده شده است. از آن جایی که سیترات در آب پرتقال موجود می‌باشد و ماندگاری زیادی بر روی ستون دارد از این‌رو انجام گرادیان مرحله‌ای با حلال با غلظت بالاتر بعد از هر کروماتوگرام به منظور شستشوی آن از ستون توصیه می‌گردد. در غیر این صورت یک پیک پهن سیترات همراه با هر کروماتوگرام مشاهده خواهد شد
اندازه‌گیری یون‌های کلرید، نیترات، فسفات، سولفات و سیترات در برخی از نوشیدنی‌های از جمله کولا و انواع لیمونادها برروی ستون Metrosep A Supp 5-100 با استفاده از حلال کربنات/ هیدروژن کربنات و آشکارسازی هدایت سنجی امکان پذیر می‌باشد. در شکل 19 جداسازی آنیون‌های موجود در این قبیل نوشیدنی‌ها مشاهده می‌شود. جهت حذف مزاحمت‌های آنیونی از حلال، بین ضربه‌گیر پالس و شیر تزریق، ستونMetrosep A Trap 1 تعبیه می‌گردد.
شکل 19-اندازه گیری آنیون های موجود در لیموناد با استفاده از آشکارسازها هدایت سنجی اندازه‌گیری کافئین به عنوان یکی از عوامل طعم دهنده در نوشیدنی‌های غیر الکلی با استفاده از مخلوط سدیم هیدروژن فسفات و متانول به عنوان حلال و آشکار‌ساز مرئی/ ماورای بنفش میسر می‌باشد که در شکل 20 مشاهده می‌شود.
اندازه‌گیری ده هیدرات کربن موجود در شکلات در شکل 21 نشان داده شده است. یک گرم از نمونه در 100 میلی لیتر آب فوق خالص حل گشته و بعد از رقیق سازی با آب به نسبت 1:100، تزریق صورت می‌گیرد.